Рутинная спермограмма не позволяет выявить ультраструктурные изменения сперматозоидов, обусловливающие нарушения эмбрионального развития плода. Наиболее частым ультраструктурным повреждением сперматозоидов является фрагментация ДНК сперматозоидов, характеризующаяся двух-цепочечными и одно-цепочечными разрывами молекулы ДНК.
Сперматозоиды даже со значительным уровнем повреждений ДНК сохраняют способность к оплодотворению яйцеклеток, но дальнейшее эмбриональное развитие может блокироваться на уровне формирования бластоцисты или уже после имплантации эмбриона в матку.
Таким образом, в андрологической лаборатории необходимо, помимо проверки стандартных параметров спермы, исследовать и целостность ДНК сперматозоидов.
Для определения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, мы предлагаем тест-систему «Блю-Тол». Поврежденная ДНК сперматозоидов из-за наличия фосфатных групп имеет сильную тенденцию к окрашиванию толуидиновым синим. Чем больше фрагментирована ДНК сперматозоидов, тем больше доступно для окрашивания фосфатных групп и интенсивнее их окраски.
При световой микроскопии сперматозоиды с поврежденной ДНК окрашены в темно-фиолетовый цвет, а сперматозоиды без повреждений — в бледно-голубой. Количественная мера оценки метахроматического сдвига (окраски) с помощью световой микроскопии представляет собой степень повреждения ДНК.
Состав тест-системы «БлюТол»
- адгезивные стекла — 10 шт
- (ГР) гидролизирующий раствор — флакон, 100 мл
- (БК) буфер красителя — флакон, 50 мл
- (Г) глицерин — флакон, 50 мл
- (К) краситель — флакон, 6 мл
- Число анализируемых проб — 10 проб
Инструкция по применению тест-системы «БлюТол»
Инструкция по применению набора реагентов для определения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.
10 исследований
Только для in vitro диагностики!
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для определения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, далее по тексту – набор, предназначен для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов человека путем дифференцированного окрашивания.
ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Состав:
адгезивные стекла; 10 шт
(ГР) гидролизирующий раствор — флакон, 100 мл
(БК) буфер красителя — флакон, 50 мл
(Г) глицерин — флакон, 50 мл
(К) краситель — флакон, 6 мл.
Число анализируемых проб: 10 проб
Принцип метода: ДНК-сперматозоидов избирательно окрашиваются реагентами входящими в состав набора
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора – класс 1.
Все компоненты в используемых концентрациях являются не токсичными.
При работе с компонентами набора следует допускать осторожность и не допускать попадания реагентов на кожу и слизистые; при попадании немедленно промыть пораженное место большим количеством проточной воды. При проглатывании следует выпить 0,5 литров воды и вызвать рвоту.
Все образцы пациентов должны рассматриваться как потенциально инфицированные, поэтому необходимо использовать одноразовые резиновые перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Все использованные материалы, которые контактировали с биологическими жидкостями следует утилизировать в контейнер для биологически опасных материалов
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ (не входят в набор)
микроскоп с увеличением х1000 (иммерсия)
лоток для окрашивания
набор пипеток-дозаторов переменного объема
центрифуга
дистиллированная вода
этанол 96%
фосфатный буферный раствор, рН 7,2
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Исследуемый материал: образец спермы, собранный в стерильный контейнер.
Материал должен быть разжижен и смешан. Гипервязкий образец спермы должен быть обработан, для приведения к нормальной вязкости. При работе с образцами спермы с концентрацией спермы меньше, чем 5 миллионов/мл, необходима обработка градиентами для получения концентрация спермы около 20 миллионов /мл.
Препараты, приготовленные из исследуемого материала, могут храниться 30 дней при комнатной температуре.
ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
Свежий эякулят разжижают при 370С в течение 30 мин.
Разжиженный эякулят промывают фосфатно-солевым буфером и центрифугируют при 800g в течение 10 минут.
Повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевым буфере и доводят до приблизительной концентрации 20 × 106 клеток/мл.
Делают тонкий мазок на адгезивном стекле (входит в состав набора), а затем сушат на воздухе в течение 30 минут.
Высохший мазок фиксируют (спирт 96%) инкубируя в течение 30 минут, а затем сушат на воздухе до высыхания образца.
Фиксированные препарат можно хранить до окрашивания в темноте при комнатной температуре до 1 недели и до 2 недель в эксикаторе при +40С, не влияя на результаты.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Адгезивное стекло с образцом погружают в гидролизующий раствор (входит в набор), инкубируя при +40 С в течение 5 мин. После этого предметное стекло промывают 3-кратно в течении 2 минут в дистиллированной воде и высушивают.
Для окраски образца необходимо приготовить буферный раствор красителя. Для чего, необходимо смешать 0.5 мл красителя (входит в набор) с 4,25 мл буфера красителя (входит в набор) и добавить 4,75 мл глицерина (входит в набор). Тщательно перемешать приготовленный буферный раствор.
Приготовленный буферный раствор красителя наносят на адгезивное стекло с образцом и выдерживают 5 минут при комнатной температуре.
Далее образец однократно промывают в дистиллированной воде и сушат на воздухе.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
На световом микроскопе с увеличением х 1000 (иммерсия) подсчитывают в общей сложности 200-300 сперматозоидов в разных полях образца.
Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК (сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в фиолетовый, темно-фиолетовый цвета) и нормальные сперматозоиды (окрашиваются в светло-голубой цвет).
Проводится подсчет количества сперматозоидов (S), количества сперматозоидов с не фрагментированной ДНК (X), количества сперматозоидов с фрагментированной ДНК (Y). S = X + Y
DFI (индекс фрагментации ДНК) рассчитывается по формуле: DFI= [Y/ S] x 100
Нормальное эталонное значение/диапазон для индекса DFI: нормальный: DFI <15%, допустимый: DFI> 15% и DFI <30%, повышенный: DFI> 30%
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВКИ И ЭКСПЛУАТАЦИИ.
Условия хранения
Набор следует хранить при температуре от 2 до 250C в течении всего срока годности. Не допускать воздействия прямых солнечных лучей.
Условия транспортировки
Может проводиться всеми видами крытых транспортных средств в соответствии с требованиями и правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта.
Условия эксплуатации После вскрытия набора, реагенты хранить в холодильнике при температуре от 2 до 80C . Компоненты набора стабильны в течении всего срока годности при условии достаточной герметичности флаконов. При использовании, все реагенты должны быть комнатной температуры .
Срок годности: 1 (один) год с даты выпуска (напечатана на внешней стороне коробки).
Видео демонстрации работы тест-системы «БлюТол»
Преимущества тест-системы «БлюТол»
1
Нет необходимости в дорогостоящем оборудовании — люминисцентной микроскопия и/или проточной цитометрии
Достаточно иметь обычный микроскоп!
2
Нет необходимости дополнительного обучения персонала лаборатории
Простота окраски и подсчета позволяет овладеть методикой персоналу имеющему опыт проведения рутинных спермиологических исследований!
3
Длительное хранение окрашенных препаратов
Это уникальное преимущество, которое позволяет вести архив образцов и использовать его при разрешении конфликтных ситуаций, связанных с контролем качества проведенных исследований!
4
Дешевизна методики
Использование тест-системы «Блю-Тол» делает определение уровня фрагментации сперматозоидов намного выгоднее, чем любая из конкурентных методик.
5
Легальность
Только тест-система «Блю-Тол» имеет всю необходимую разрешительную документацию для использования в РФ.
6
Бесплатный пробный образец
Вы всегда можете бесплатно заказать пробный образец, чтобы принять решение о повседневной работе с тест-системой «Блю-Тол».
